Маржан Сыпабекова, биолог: «Биосенсор позволяет диагностировать туберкулез за 15 минут»

Зачем изучать туберкулез?

На постсоветском пространстве проблема туберкулеза очень актуальна, особенно из-за мультирезистентных штаммов. Это значит, что бактерию невозможно убить одной серией антибиотиков, нужны антибиотики запаса, более агрессивные их формы. Во время PhD я также хотела понять, почему устойчивость к антибиотикам увеличивается, и спросила об этом врачей столичного тубдиспансера. Многие пациенты не долечиваются и покидают больницу, потом заражаются снова, заражают других, и, таким образом, палочки Коха превращаются в устойчивых монстров. Существует протокол с довольно сильными лекарствами, он утвержден ВОЗ, но побочные эффекты у этих антибиотиков очень страшные, вплоть до галлюцинаций, на пациентов больно смотреть. Мы заключили меморандум с тубдиспансером для того, чтобы протестировать наш биосенсор на клинических образцах. Целью нашего проекта было создать платформу для быстрого и специфичного метода диагностики туберкулеза. Сейчас уже существуют разные методы, но, к сожалению, они не доступны простому гражданину.

Те платформы, что используются в поликлиниках и больницах, требуют времени: от одного дня до двух недель. Микобактерия туберкулеза растет очень медленно, поэтому нужно ждать до двух недель. А для проведения ПЦР-теста у нас в тубдиспансере в 2018 году стояла только одна машина. Как мне сказали, она была предоставлена Всемирной организацией здравоохранения, но к сожалению, на ней анализируют не все образцы, а только образцы критических больных.

О детстве, даче и любви к природе

Я родилась и выросла в городе Тараз. Я очень люблю казахскую литературу и казахский язык, в детстве любила играть на домбре. Это у меня от дедушки, он был очень красноречивым человеком, хотя и отучился всего 4 класса. Я помню, как он лежал на диване и наизусть читал поэму «Қыз Жібек», а я сидела в кресле и слушала его. У нас в семье четверо детей: три девочки и мальчик. Сестры не любили возиться с землей, поэтому мне приходилось ехать на дачу за городом. Час-полтора на автобусе с вёдрами, там у нас была времянка с большим огородом с арычным поливом. Я поливала, следила, как росли разные растения. И часами любила наблюдать за жучками и паучками. Поэтому биология в школе мне давалась легко. Учителя это заметили и начали готовить к олимпиадам по биологии. После школы я видела единственный путь — медицинский факультет. И поступила в Астанинский Медицинский Университет, там отучилась год. Но потом получила стипендию «Болашак» и уехала в Великобританию учиться на биотехнолога.

Учеба в Шотландии и первые эксперименты

Я училась в Шотландии, в Университете Глазго. Сначала мне было сложновато в плане языка. Но больше всего меня поражало то, как студенты свободно высказывали своё мнение, не боясь вслух сказать неверный ответ. Мне же сложно было отвечать перед всеми, делать критический анализ, но постепенно я научилась этому. Мне казалось, что мне не хватает практических навыков, а поэтому каждое лето я искала стажировку в лаборатории, домой приезжала максимум на две-три недели. Летом после первого курса я нашла стажировку на факультете ботаники. Там изучала взаимодействие белков растений на примере модели арабидопсиса (самая известная биологическая модель среди растений, на латинском Arabidopsis thaliana — прим. автора). Белок, который я изучала, называется UVR8. Он отвечает за защиту растения от пагубного воздействия ультрафиолетового излучения Солнца. Интересно то, что аналог этого белка существует и у людей. Профессор Gareth Jenkins, с которым я работала, хотел изучить взаимодействие этого белка с другим белком и то, как оно влияет на функции генов. Я продолжала с ними работать во время первого и второго курсов, была единственным студентом-бакалавром у него в лаборатории. Моя стажировка спонсировалась Dobbie Smith Prize и Nuffield Bursary — специальными программами для студенческих проектов. Этих денег хватало, чтобы оплачивать жилье и питание во время каникул. Я не жалею, что проводила свои каникулы в лаборатории, потому что практические навыки, которые я получила в то время, использую до сих пор.

Знакомство с биосенсорами

Когда я вернулась с учебы в Казахстан, то устроилась на работу в Назарбаев Университет — в команду Дамиры Канаевой, она является assistant-профессором на факультете биологии. Во время PhD Дамира проводила исследования по разработке биосенсоров. Эта тематика мне понравилась тем, что она междисциплинарна: нужна не только биология, но и биофизика, биоинженерия и другие научные направления. У нас был проект с целью разработать биосенсор для детекции микобактерии туберкулёза. Когда я начала работать в этом направлении, то поняла, что знаний, полученных мной в Великобритании, недостаточно, и поэтому решила поступить на магистратуру. Поехала учиться в Ecole normale supérieure de Cachan во Францию на курс бионанофотоники. Вообще Ecole normale supérieure — это не университет, а высшая школа, где учатся магистранты и докторанты. Таких школ во Франции немного, пять или шесть. Когда мы выбирали руководителя для магистерской работы, я выбрала доктора Claude Nogues — специалиста по применению химии поверхностного состояния в биомедицинских целях. Эта команда занималась разработкой биосенсоров на основе поверхностного плазмонного резонанса. Похожее оборудование как раз было у нас в Назарбаев Университете, и мне хотелось научиться на нем эффективно работать. На этом проекте я проработала 6 месяцев.

Как ВИЧ встраивается в ДНК? Кусочек пазла

Поверхностный плазмонный резонанс — это методика, с помощью которой мы можем определить аффинность биомолекул друг к другу, то есть то, насколько они тянутся друг к другу, как сильно взаимодействуют. Используется металлическая поверхность, на которую прикрепляется определенная молекула (рецептор), например, антитело. Затем мы пропускаем раствор других молекул, возможных антигенов. Когда происходит взаимодействие между двумя молекулами, меняется угол преломления светового сигнала. Это считывается машиной, и мы можем таким образом измерить силу взаимодействия. Лаборатория, в которой я работала, использует такие методы для сугубо фундаментальных исследований, главным образом изучая вирусы. В моей магистерской работе мы использовали этот метод для изучения вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).

Для того, чтобы это сделать, интеграза должна распознать определенную часть ДНК вируса, так называемую палиндромную последовательность (как и в словах-палиндромах, генетический код в таких последовательностях написан наоборот — это позволяет формировать из ДНК комплексные структуры — прим. автора). Так вот, моей задачей было точечно изменить эту часть ДНК — мутировать её и проверить, меняется ли из-за этого взаимодействие с вирусной интегразой. Я смоделировала и синтезировала десять разных структур, и в итоге мы сделали заключение о том, что интеграза действительно взаимодействует с палиндромными последовательностями и это взаимодействие очень специфично для конкретного генетического кода. Мне предложили подать документы на докторантуру и остаться в этой лаборатории, но я решила вернуться в Назарбаев Университет и продолжить работу над биосенсором. К счастью, как раз в это время там открылась первая PhD-программа, на которой я проучилась с 2015 по 2019 год.

И снова за парту: электрохимия

Биосенсор — это устройство, которое определяет биомолекулы и состоит из двух главных компонентов. Первый компонент — это поверхность, куда мы прикрепляем рецептор, который распознает биомаркер. Второй слой — это преобразователь (transducer). Преобразователь улавливает сигнал, который происходит от взаимодействия рецептора и биомолекулы. Потом этот сигнал превращается в другой сигнал, который мы уже видим на мобильном телефоне или на компьютере. Преобразователь и определяет вид биосенсора — передача сигнала может осуществляться разными методами, следовательно, биосенсоры бывают электрохимические, оптические, магнетические и т.д. Для нашего проекта мы сначала планировали создать оптический биосенсор, но во время моего PhD мы решили переключиться на электрохимические биосенсоры, так как этот вид биосенсоров намного чувствительнее остальных, вплоть до детекции движения электронов. На тот момент я вообще абсолютно ничего не знала про электрохимию. Я чувствовала, что не дотягиваю и мне надо получить какой-то опыт от специалистов. Поэтому я подала на грант по программе Newton-Al Fаrabi от Британского консульства. По этому гранту я поехала в Университет Бата (University of Bath), где есть Центр биосенсоров, биоэлектроники и биодевайсов под руководством доктора Педро Эстрелы. Он фокусировался на разработке электрохимических биосенсоров. Я работала там 4 месяца. Там меня как первоклассницу учили, как соединять электроды и всем базовым методам электрохимии. Я получила там колоссальный опыт, в том числе училась, как правильно планировать эксперименты. После этого, вернувшись в Назарбаев Университет с совершенно другими знаниями и навыками, продолжила проект, сделала свой ряд экспериментов и получила хорошие результаты, которые мы смогли опубликовать.

MPT64 — мишень биосенсорa

В качестве преобразователя мы использовали потенциостат. Он измеряет сопротивление от взаимодействия нашего рецептора с биомолекулой. В качестве рецептора мы использовали синтетические молекулы, которые называются аптамерами. А биомаркером, который будет распознаваться биосенсором, в данном случае является белок MPT64. Получается вот такой сэндвич. Вообще с палочкой Коха действительно сложно работать. У нас не было разрешения выращивать её в лаборатории, потому что требуется другой уровень биобезопасности. Поэтому нам пришлось работать только с белками. У нас было изначально несколько кандидатов. Мы выбрали MPT64 — один из белков, который выделятся микобактерией туберкулеза, когда она активно делится, так как нашей целью являлась диагностика активной стадии туберкулеза. Функция MPT64 для палочки Коха огромна. Он не только секретируется, но и влияет на микросреду в клетках. MPT64 присутствует у всех штаммов микобактерии туберкулеза, в том числе у мультирезистентных. А это значит, что этот белок может быть своего рода универсальным маркером. Однако он был мало изучен в качестве мишени для диагностики. Поэтому мы выбрали его в качестве главного объекта для диагностики.

Как поймать MPT64?

Для того, чтобы распознать белок туберкулезной палочки (замóк), нам нужно подобрать рецептор (ключ), который будет специфически связываться с белком-мишенью. В качестве рецептора в нашем биосенсоре используются аптамеры. Аптамер (от лат. "aptus" - подходить) – это одноцепочечная ДНК длиною от 25 до 45 нуклеотидов. Новизна использования аптамеров, как рецепторов, состоит в том, что они очень устойчивы к разным условиям по сравнению с антителами. Например, антитела мы должны хранить при определенной температуре (при -20С или +4С). Аптамеры же можно хранить продолжительное время при комнатной температуре. Они производятся синтетически, их можно заказать у специальных компаний, которые занимаются синтезом аптамеров. Получив библиотеку с разными последовательностями аптамеров, мы должны выбрать те, что эффективно присоединяются к нашему белку-мишени. Этот процесс называется SELEХ (Sequential Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). Мы помещаем аптамеры в раствор с нашим белком на определенное время (от одного часа и дольше), затем пропускаем этот раствор через фильтр (1). Промыв фильтр с помощью буферных растворов, мы получаем те аптамеры, которые эффективно распознают белок (2). Затем мы воспроизводим много копий работающих аптамеров (3) и повторяем цикл еще 10-20 раз, чтобы выбрать самые лучшие молекулы (4). Уходит на этот процесс от трех месяцев до года. Этот метод селекции также хорош тем, что это по сути обычная молекулярная биология, особого оборудования не нужно.

Тестирование биосенсора в лаборатории

В итоге мы отобрали 17 последовательностей аптамеров. Их мы изучаем с помощью поверхностного плазмонного резонанса. Мы досконально изучаем, как сильно молекулы связываются, как быстро аптамер отсоединяется от белка и т.д. Из этих 17 кандидатов я выбрала одну последовательность, над которой я дальше продолжала работать. Её мы насаждаем на поверхность электрода и измеряем степень соединения с белком на основе измерения сопротивления. Затем мы должны оптимизировать поверхностную химию. Мы должны рассчитать плотность аптамеров на поверхности, выбрать молекулы, с помощью которых мы сделаем этот аптамер специфичным, и в итоге мы начинаем первые тесты биосенсора в лаборатории. Для этого мы берём сыворотку крови (её можно купить уже готовую у разных компаний). В этой сыворотке мы растворяем наш белок MPT64. Сыворотка очень богата разными белками, биомолекулами, даже иногда клетками. Нам такая среда и нужна, чтобы максимально приблизить условия к клиническим образцам. Такие эксперименты часто называются spike and recovery sample experiments. В нашем случае сенсор смог опознать сам белок, но также было и неспецифическое связывание, когда аптамер реагирует и на другие белки (это может привести к ложноположительным результатам). Это проблема всех биосенсоров, и на данный момент ученые всё ещё над этим работают. Мы рассчитали, что наш биосенсор достаточно специфичный и эффективный на лабораторных образцах.

Клинические тесты и интерес врачей

Однако для того, чтобы полностью ответить на вопрос об эффективности, нам нужен доступ к клиническим образцам. У меня было всего 20 клинических образцов реальных пациентов, и я не могла на основе этого сделать заключение об эффективности теста. Есть такой термин «response time», то есть, за какое время можно получить результат теста. Мы снизили это время до 15 минут. А тест на основе ПЦР, к примеру, длится не меньше 2 часов. В плане портативности этого сенсора тоже имеются преимущества по сравнению с оборудованием, которое находится в больницах.

А дальше для создания прототипа требуются и биологи, и инженеры, чтобы сделать оптимальный дизайн, чтобы установить батареи, которые работают долгосрочно.

Что касается клинических исследований, существует пропасть с точки зрения коммуникации между врачами и учеными. Врачи тоже должны быть вовлечены в научные исследования. Несмотря на то, что у нас намного дешевле делать клинические исследования, у нас не хватает интереса со стороны врачей. С другой стороны, наши врачи загружены другой работой. Во время бакалавриата в Шотландии один год с нами учились студенты-медики. Целый год студенты-медики изучали только молекулярную биологию! Поэтому, когда мы с ними делали проекты на 3 курсе, было очень интересно. Они объясняли проблему с точки зрения медицины, а мы со стороны науки. Мне кажется, что этого не хватает в медицинских вузах, чтобы у них также был опыт в фундаментальных исследованиях.

Биосенсоры для борьбы с биотерроризмом

После защиты PhD я осталась в Назарбаев Университете и продолжаю исследования, но уже в другой лаборатории. В течение полутора лет я также занималась темой биосенсоров, но на этот раз на основе оптических волокон под руководством доктора Даниэле Тосси совместно с доктором Люка Вангелиста из Медицинской Школы НУ. Этот проект спонсируется НАТО и имеет отношение к биобезопасности, так как мы изучаем механизмы для детекции семейства поксвирусов (к которому, к примеру, относится натуральная оспа). Эти вирусы могут быть потенциальными агентами для биотерроризма. Я изучаю белки, которые находятся на поверхности таких вирусов. Я их моделирую, экспрессирую и очищаю, то есть произвожу их в лаборатории с помощью генетической инженерии. Затем эти белки закрепляю на поверхности оптических волокон. Представьте один волос — это и есть примерный размер оптического волокна. На поверхности такого волокна и происходит детекция вирусного белка. Как превратить это взаимодействие в оптический сигнал? На данный момент мы изучаем разные конфигурации оптических волокон. Свет преломляется по-разному в зависимости от строения волокна. В структуре волокна есть участки, которые более чувствительны, туда мы и помещаем наши белки. Основная часть экспериментов для этого проекта проводится в Казахстане на базе НУ. Именно здесь мы разрабатываем сенсор, а затем собираемся тестировать его в лабораториях наших зарубежных партнеров — в Италии и Албании. Без международного сотрудничества осуществить этот проект практически невозможно. Мы обмениваемся опытом, делимся экспертизой. То, что разрабатывается там, мы привозим сюда, тестируем в Казахстане, и наоборот.

Работа во время пандемии

Во время пандемии несколько месяцев я не могла работать в лаборатории. Это было для меня очень продуктивное время: я, наконец, могла спокойно проанализировать и систематизировать полученные до этого данные, мы с руководителем написали обзорные статьи и даже целую книгу. На самом деле, пандемия в этом плане мне очень помогла. Я обожаю читать и писать обзорные статьи, это своего рода перезагрузка, чтобы понять, что сейчас происходит в науке. Затем в августе мы вернулись в лаборатории и каждые две недели сдаем ПЦР. Все встречи по проекту проходят онлайн, я своего руководителя в живую не видела со времен начала пандемии, уже больше года. Но мы встречаемся онлайн раз в неделю, и этого достаточно, работа не останавливается. Мы стараемся тщательно планировать эксперименты и бронировать оборудование заранее, чтобы уменьшить количество людей в лаборатории. Основную часть анализа и написания статей я продолжаю делать дома. Конечно, это тоже непросто, особенно когда дома маленькие дети. Но мамам-ученым бывает сложно и вне пандемии. Когда я начала PhD, старшей дочке было всего 6 месяцев. Потом, во время PhD, я родила второго ребёнка и так же после полугодового декрета вышла на работу. Всё это время мне помогали родители мужа. У нас, конечно, очень мало условий для кормящих мам. Мне приходилось кормить ребёнка в коридоре между экспериментами.

Современную науку в школьную программу!

В 2012 году я с другими учеными в течение года преподавала биологию в НИШ. Это был очень интересный опыт, некоторые из моих учеников потом пришли учиться в НУ. Я бы полностью поменяла подход к преподаванию биологии в школах. Сейчас наука не стоит на месте: новые методы, новые технологии, новые виды экспериментов. Вот эту новизну надо преподавать ученикам, не то, что было когда-то, а то, что происходит в науке сейчас. Мне кажется, что это было бы интереснее и учителю, и ученику. Учитель ведь не только преподаёт, он отвечает за контакт ученика с миром науки. Педагогам необходимо обучение навыкам коммуникации, основам психологии, чтобы учиться не травмировать детей.

Универсальные солдаты в науке

Сейчас биология, как и наука в целом, междисциплинарна. Нужно быть разносторонним, универсальным, иметь хорошую базу по разным направлениям. Это не какой-то модный тренд, это необходимость. Когда я езжу на конференции, я часто удивляюсь тому, какие разносторонние там бывают люди. Они знают не только биологию, они знают практически всё. И разговаривать с ними одно удовольствие. Рядом с ними чувствуешь, что ничего не знаешь и надо ещё учиться несмотря на то, что у тебя есть PhD или постдок. Мне кажется, я ещё не сформировалась как специалист, мне ещё многому нужно учиться. Например, сейчас я планирую освоить программирование, не знаю, получится или нет, но я очень сильно постараюсь, потому что для моей специальности сейчас это очень нужный навык.

Нам надо расширять направление по разработке биосенсоров в стране, подключать другие вузы. Остаются проблемы с организацией закупок — так же, как и 10 лет назад, реагенты приходят через полгода после заказа. Вот прямо сейчас я жду доставку реагентов для экспрессии белков. Во время работы во Франции, в Англии, реагенты приходили вечером в тот же день или на следующий день. Это очень демотивирует. Основная проблема, которая тянет ученых вниз — это административная работа. А по части финансирования — Министерство образования финансирует, в этом году увеличилось количество грантов, что радует. Но если честно, я сама не берусь за МОНовские гранты, потому что там много отчётов, после которых нет мотивации работать.

Казахстанская наука: пациент скорее жив или мертв?

Конечно, жив. Надо много работать, чтобы он продолжал жить.

Автор благодарит Дарию Гылымжанкызы за помощь в подготовке материала.

Данная публикация стала возможной благодаря помощи американского народа, оказанной через Агентство США по международному развитию (USAID) в период с 05.03.2021 по 04.07.2021, и был подготовлен в рамках «Центральноазиатской программы MediaCAMP», реализуемой Internews при финансовой поддержке USAID. Проект «Gylym Faces» несёт ответственность за её содержание, которое не обязательно отражает позицию USAID, Правительства США или Internews.